انسداد ستون HPLC یکی از استرس‌زاترین مشکلات برای هر کاربر کروماتوگرافی است که به صورت افزایش ناگهانی یا تدریجی فشار سیستم خود را نشان می‌دهد. یک ستون گران‌قیمت ممکن است بر اثر این مشکل به طور دائم آسیب ببیند. اقدام سریع اما ایمن و آگاهانه برای نجات ستون حیاتی است. این مقاله به شما می‌آموزد که چگونه انسداد را تشخیص دهید، منشأ آن را پیدا کنید و با استفاده از پروتکل‌های صحیح شستشو، آن را برطرف نمایید.

پروتکل ایمن شستشوی معکوس (Backflush) برای پاکسازی گرفتگی در فریت ورودی ستون

علائم و تشخیص انسداد ستون

• افشار مداوم و غیرعادی: فشار سیستم به طور پیوسته از حد نرمال کارکرد (مثلاً ۱۰۰ بار) بالاتر می‌رود. این مهم‌ترین نشانه است.
• تغییر شکل پیک‌ها: پیک‌ها پهن، کشیده یا دارای دنباله (Tailing) می‌شوند، زیرا ذرات مانع جریان یکنواخت می‌گردند.
• تست قطعی: ستون را از سیستم جدا کرده و به جای آن یک اتصال کوتاه (Union یا قطعه کاپیلاری) ببندید. اگر فشار به حالت نرمال پایین برگشت، مشکل قطعاً از ستون یا Gard Column است. اگر فشار همچنان بالا بود، مشکل از بخش‌های دیگر مانند پمپ، لوله‌ها یا دتکتور است. برای بررسی سایر علل فشار بالا، مقاله "نوسان فشار در HPLC: علت‌ها، تست سریع، و راه‌حل‌های عملی" را ببینید.

علل شایع گرفتگی ستون HPLC

1. ذرات معلق در نمونه: شایع‌ترین علت. تزریق نمونه‌های فیلتر نشده (با فیلتر ۰.۲۲ یا ۰.۴۵ میکرون) باعث تجمع ذرات در فریت (Frit) ورودی ستون می‌شود.
2. رسوب نمک‌های بافر: هنگامی که بافر (مثل فسفات) در تماس با درصد بالای حلال آلی قرار می‌گیرد، می‌تواند رسوب کرده و مجرای ستون را ببندد.
3. تشکیل حفره (Void) در سر ستون: اگر فریت آسیب ببیند یا ذرات ریز از آن عبور کنند، در بستر فاز ساکن حفره ایجاد می‌شود که خود می‌تواند باعث گرفتگی ثانویه شود.
4. رشد میکروارگانیسم‌ها: در بافرهای آبی که برای مدت طولانی در سیستم مانده‌اند، باکتری‌ها ممکن است رشد کنند.
5. آلودگی‌های شدید (Strongly Retained Compounds): تجمع آلاینده‌های بسیار قوی روی فاز ساکن، هرچند نادر، می‌تواند جریان را محدود کند.

راهنمای گام‌به‌گام رفع ایمن گرفتگی

هشدار: قبل از شروع، دفترچه راهنمای ستون خود را برای دستورالعمل‌های اختصاصی پاکسازی بررسی کنید. هرگز جهت جریان را برعکس نکنید مگر اینکه سازنده مجاز دانسته باشد.

1. تعویض یا حذف ستون محافظ (Guard Column): اولین و ساده‌ترین اقدام. اگر فشار پایین آمد، مشکل از Gard Column بوده است.
2. شستشوی ستون با حلال‌های قوی (طبق دستور سازنده):
   • برای آلودگی‌های آلی: شستشو با گرادیان از آب به %۱۰۰ آسانتریتی (مانند استونیتریل یا متانول).
   • برای رسوب بافر: ابتدا با آب خالص (حداقل ۲۰ حجم ستون) برای حذف نمک‌ها شستشو دهید. سپس به حلال آلی منتقل شوید.
   • از تغییرات ناگهانی حلال (مثلاً از بافر به %۱۰۰ آلی) خودداری کنید زیرا باعث رسوب بیشتر می‌شود.
3. شستشوی معکوس (Backflush) با احتیاط:این قوی‌ترین روش برای پاکسازی فریت ورودی است.
   1. ستون را از سیستم جدا کنید.
   2. جهت جریان روی بدنه ستون را بررسی کنید. ستون را برعکس در سیستم نصب کنید (انتهای ستون به پمپ، ابتدای ستون به دتکتور).
   3. با دبی بسیار پایین (مثلاً ۰.۲ میلی‌لیتر بر دقیقه) و با حلال مناسب (مثلاً %۱۰۰ استونیتریل) شستشو را شروع کنید.
   4. فشار را به دقت مانیتور کنید. اگر فشار ابتدا بالا بود و سپس به طور ناگهانی افت کرد، نشانه آزاد شدن گرفتگی است.
   5. حداکثر ۱۰-۱۵ حجم ستون شستشو دهید، سپس ستون را در جهت صحیح بازنصب کنید.
4. تعویض فریت (Frit) سر ستون: اگر تمام روش‌ها شکست خورد و ستون بسیار ارزشمند است، این کار توسط متخصصان می‌تواند انجام شود. شرکت پرتوشار این خدمت تخصصی را ارائه می‌دهد.

پیشگیری، بهترین راه‌حل

اگر فشار ستون شما پس از انجام این مراحل به حالت عادی بازنگشت، ممکن است آسیب جدی‌تری مانند حفره (Void) در بستر ستون ایجاد شده باشد که نیاز به مشاوره تخصصی دارد. برای آشنایی با سایر مشکلات رایج، می‌توانید مقاله اصلی "تعمیر HPLC (اچ‌پی‌ال‌سی): رایج‌ترین خرابی‌ها + عیب‌یابی مرحله‌به‌مرحله" را مرور کنید.

حرف آخر تکنسین‌های پرتوشار:
«ستون مغز دستگاه HPLC است. پیشگیری از انسداد، بسیار کم‌هزینه‌تر از تعمیر یا تعویض آن است. دو قانون طلایی: ۱) نمونه را فیلتر کن. ۲) از Gard Column استفاده کن. اگر فشار بالا رفت، خونسردی خود را حفظ کرده و قدم‌به‌قدم و با احتیاط پیش بروید.»