تعمیر کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC

اصول اولیه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC

کروماتوگرافی با کارایی بالا high performance liquid chromatography یک تکنیک ویژه است که در آنالیزهای شیمیایی برای جداسازی ، شناسایی و اندازه گیری کمی ترکیبات در مخلوط ها استفاده می شود. اساس کار  کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC بر این روش استوار است که حلال مایعی که شامل مخلوطی از نمونه ها است با فشار بالا به داخل کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC پمپ می شود و مخلوط از درون یک ستون که با مواد جاذب جامد پر شده است، عبور می کند. هر نمونه درون این حلال در حال عبور از درون ستون کروماتوگرافی، که به ترتیب فاز متحرک و فاز ساکن نامیده می شوند، با فاز ساکن و جامد درون ستون برهمکنش دارد و بصورت لحظه به لحظه بین فاز ساکن و فاز متحرک تعادلات پی در پی ایجاد می شود. بر اساس تمایل بیشتر یا کمتر نمونه به فاز ساکن، این تعادلات لحظه ای باعث می شوند تا نمونه هایی که تمایل برهمکنش بیشتری با فاز ساکن دارند نسبت به نمونه هایی که تمایل کمتری به فاز ساکن دارند، دیر تر از ستون کروماتوگرافی خارج شوند. در نتیجه نمونه هایی که در ابتدای ستون با هم مخلوط همگنی هستند، در انتهای ستون بصورت مجزا خارج می شوند.

نحوه انجام کروماتوگرافی با کارایی بالا HPLC

مخلوط نمونه هایی که برای جداسازی به محصولات کروماتوگرافی مایع اعمال می شود معمولا در حجم های پایین در حدود چند میکرولیتر به دستگاه تزریق می شود و این مخلوط به درون یک فاز متحرک یا mobile phase وارد می شود و با هم از درون ستون عبور می کند. اجزاء نمونه در طول ستون با سرعت های متفاوتی عبور می کند که این سرعت تابعی از ویژگی های شیمیایی و برهمکنش های فیزیکی فاز متحرک و فاز ساکن است. زمانیکه هر نمونه خاص از طول ستون می گذرد و در آن طرف دیده می شود به زمان ماند یا retention time هر نمونه معروف است.

انواع کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا یا HPLC

  • کروماتوگرافی مایع فاز نرمال Normal phase HPLC

این تکنیک یکی از اولین روش های مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC است. در این روش نمونه ها بر اساس تمایل آنها به یک فاز قطبی مانند سیلیکا از هم جدا می شوند. علاوه بر این، توانایی نمونه ها به درگیر شدن در برهمکنش های قطبی مانند برهمکنش های پیوند های هیدروژنی یا برهمکنش های پیوند دوگانه با پیوند دوگانه نیز اهمیت دارد. در کروماتوگرافی فاز نرمال از فاز متحرک غیر قطبی و یا غیر آبی استفاده می شود مانند کلروفرم این روش بطور موثری برای جداسازی نمونه هایی که به راحتی در حلال های غیر قطبی حل می شوند مناسب است. نمونه ها در فاز ساکن قطبی درگیری دارند و هر نمونه ای که قطبیت بیشتری داشته باشد، بیشتر درگیر می شود. قطبیت بیشتر یعنی جذب بیشتر. قدرت برهمکنش نه تنها تابعی از گروههای عاملی موجود در ساختار مولکولی نمونه است  بلکه تابعی از فاکتور استری است. فاکتور استری امکان جداسازی ایزومرهای ساختاری را به کاربر می دهد.

استفاده از حلال های کمی قطبی تر در فاز متحرک، با عث می شود که زمان ماند نمونه در ستون کمتر شود چون نمونه غیر قطبی با دو فاز قطبی تر کمتر برهمکنش خواهد داشت. داشتن مقادیر بسیار کم از آب در فاز متحرک باعث آب پوشی سطح فاز ساکن خواهد شد که نتیجه آن کاهش بیشتر زمان ماند نمونه خواهد شد.

  • کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا با فاز معکوس Reverse phase HPLC

این روش کروماتوگرافی مایع شامل یک فاز ساکن غیر قطبی و یک فاز متحرک آبی یا نسبتا قطبی است، برعکس کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا با فاز نرمال. یکی از معمول ترین فاز های ساکن مورد استفاده در این روش، سیلیکایی است که سطح آن به وسیله گروه های دارای شاخه های کربنی بین 8 تا 18 کربن، اصلاح شده است و این گروههای عاملی سطحی بصورت RMe2SiCl نشان داده می شوند که در آنها R همان شاخه های کربنی دارای 8 تا 18 کربن هیتند. با این فاز ساکن، زمان ماند نمونه در ستون برای نمونه هایی با قطبیت کمتر، بیشتر خواهد شد. با تغییر میزان قطبیت فاز متحرک مثلا افزودن کمی آب به فاز متحرک، می توان زمان ماند نمونه را درون ستون بیشتر کرد.

  • کروماتوگرافی مایع بر اساس اندازه نمونه یا کروماتوگرافی طردی

این روش کروماتوگرافی همچنین به روش کروماتوگرافی ژل تراوایی یا فیلتر کردن ژلی نیز معروف است که یکی دیگر از تکنیک های کروماتوگرافی HPLC می باشد. در این روش نمونه ها بر اساس سایز و اندازه مولکولی شان از هم جدا می شوند. این تکنیک دارای رزولوشن پایینی است و معمولا به عنوان گام آخر در مرحله خالص سازی استفاده می شود. در این روش مولکول های بزرگتر که نمی توانند وارد حفرات فاز ساکن شوند، از درون ستون عبور می کنند و مولکول های ریز تر که داخل حفرات گیر می افتند، دیرتر از ستون عبور خواهند کرد. پس مولکول های ریزتر دارای زمان ماند بیشتری در ستون هستند.

  • کروماتوگرافی مایع تبادل یونی

این روش کروماتوگرافی که یکی دیگر از روش های کروماتوگرافی HPLC است که بر اساس برهمکنش و جذب یونهای موجود در حلال و بارهای مستقر در سطح فاز ساکن، جداسازی را انجام می دهد. یونهای محلول که دارای بار مشابه با فاز ساکن هستند، طرد می شوند در حالیکه یونهایی که بار مخالف با بار سطح فاز ساکن دارند، در ستون باقی می مانند. این یونهای باقی مانده درون ستون، با تغییر وضعیت فاز متحرک مثلا با افزایش قدرت یونی فاز متحرک که به کمک افزودن نمک به حلال انجام می شود، یا افزایش دمای ستون و یا تغییر pH محلول و سایر روش های دیگر به راحتی از داخل ستون خارج خواهند شد.

روش های دیگری در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا وجود دارد که با توجه به پرکاربرد تر بودن روش های فوق به توضیح آنها پرداختیم.

انواع دتکتورهای مورد استفاده در HPLC

دتکتورهای کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا به دو دسته اصلی تقسیم میشوند.

  • دتکتورهای عمومی universal 
  • دتکتور های انتخابی یا selective

این نوع دتکتورها بیشتر توده و کل خروجی را با سنجش تفاوت ایجاد شده در خصوصیات فیزیکی فاز متحرک مانند ضریب شکست refractive index، بررسی می کنند در حای که در دتکتورهای انتخابگر، یک خصوصیت خاص از آنالیت اندزه گیری می شود مانند جذب نور ماوراء بنفش یا مرئی UV-Vis absorbance که یک خصوصیت فیزیکی یا شیمیایی از آنالیت بررسی می شود.

پرکاربردترین دتکتورهای کروماتوگرافی HPLc شامل موارد زیر است:

  • دتکتور UV-Vis
  • دتکتور فلوئورسانس
  • دتکتور charged aerosol detector
  • دتکتور mass

در موارد زیادی امکان استفاده از دتکتور های ترکیبی نیز وجود دارد مانند UV-Vis-mass یا استفاده از چند دتکتور Mass پشت سر هم و غیره.

واحد خدمات فنی و مهندسی شرکت پرتوشار با سال‌ ها سابقه تخصصی در زمینه تجهیزات آنالیز دستگاهی، دارای تاییدیه رسمی از شرکت‌های معتبر و با همراهی دیگر متخصصین تجهیزات آنالیز دستگاهی داخلی و خارجی مشغول به فعالیت بوده و آماده ارائه هر نوع خدمات مربوط به تعمیر کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا High Performance Liquid Chromatography شرکت هایی نظیر Agilent، Perkin Elmer، Ewai و غیره می باشد.

1مجموع 3 پروژه
1مجموع 3 پروژه
10 / 10
از 1 کاربر