کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC

کلمه HPLC مخفف عبارت کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا می باشد. همچنین به کروماتوگرافی مایع فشار بالا نیز گفته می شود.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC یک روش جداسازی است که شامل موارد زیر می باشد:

تزریق حجم کمی از نمونه مایع درون یک لوله پر شده از ذرات متخلخل (فاز ساکن) جایی که اجزای نمونه توسط یک مایع در اثر جاذبه در طول لوله پرشده (ستون) حرکت می کنند.

سپس جداسازی اجزای نمونه توسط پرکننده ستون که شامل برهمکنش های متنوع شیمیایی و فیزیکی بین مولکول ها و ذرات پرکننده است، صورت می گیرد. اجزای جدا شده در خروجی این ستون جمع آوری شده و با یک روش اندازه گیری خارجی مانند یک طیف سنج که شدت رنگ را اندازه گیری می کند و یا ابزار دیگری که قادر به اندازه گیری مقدار آن ها باشد، شناسایی می شوند. 

تاریخچه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC

در آغاز دهه 60 میلادی، HPLC به عنوان کروماتوگرافی مایع فشار بالا شناخته شد و در پایان دهه 70 میلادی، پیشرفت مواد ستون و کروماتوگراف مایع با کارایی بالا HPLC اتفاق افتاد. پس از آن از ابتدای دهه 80 میلادی، انقلابی در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC آغاز شد و از سال 2006 موارد جدیدی مانند UPLC, RRLC, UFLC, RSLC و... شکل گرفتند.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC یک تکنیک جداسازی است که شامل موارد زیر می باشد:

• تزریق حجم کمی از نمونه مایع به درون یک لوله پرشده از ذرات ریز (با قطر 5-3 میکرومتر، به عنوان فاز ساکن) جایی که اجزای نمونه توسط یک مایع (فاز متحرک) با فشار بالا در اثر یک پمپ، در طول لوله پرشده (ستون) حرکت می کنند.
• جداسازی اجزای نمونه توسط پرکننده ستون که شامل برهمکنش های متنوع شیمیایی و فیزیکی بین مولکول ها و ذرات پرکننده است، صورت می گیرد.
• اجزای جدا شده در خروجی این ستون توسط یک آشکارساز شناسایی و مقادیرشان اندازه گیری می شود. نتیجه خروجی از این آشکارساز "کروماتوگرام مایع" نامیده می شود.
• در واقع کروماتوگراف مایع LC و کروماتوگراف مایع با کارایی بالا HPLC به روش یکسان عمل می کنند به جز در سرعت، کارایی، حساسیت و سادگی عملکرد که کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC بسیار برتری دارد.

اجزای اصلی یک کروماتوگراف مایع با کارایی بالا HPLC و عملکرد آن ها

• پمپ کروماتوگراف مایع با کارایی بالا HPLC

نقش پمپ در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC در حرکت دادن یک مایع (فاز متحرک) با فشار در طول کروماتوگراف مایع با سرعت جریان مشخص بر اساس میلی لیتر بر دقیقه می باشد.  سرعت جریان معمول در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC در گستره 1-2 میلی لیتر در دقیقه می باشد. پمپ های معمول کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC می توانند به فشارهایی در محدوده psi9000-6000 نیز برسند. در طول آزمایش کروماتوگرافی یک پمپ می تواند یک ترکیب فاز متحرک ثابت (ایزوکراتیک) یا افزایشی (گرادیانی یا شیبی) را منتقل کند.

• سیستم تزریق نمونه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC

سیستم تزریق نمونه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC نمونه مایع را به جریان فاز متحرک وارد می کند. حجم نمونه در سیستم تزریق نمونه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC به طور معمول بین 5 تا 20 میکرولیتر می باشد. همچنین تزریق کننده باید قادر به تحمل فشارهای بالای سیستم مایع باشد. اتوسمپلر نسخه خودکار نمونه برداری کروماتوگراف مایع با کارایی بالا HPLC برای زمانی است که کاربر نمونه های زیادی برای آنالیز داشته و یا اینکه تزریق دستی شدنی نیست.

• ستون کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC

با در نظر گرفتن قلب دستگاه کروماتوگرافی، فاز ساکن ستون اجزای نمونه را با استفاده از پارامترهای مختلف فیزیکی و شیمیایی، جداسازی می کند. ذرات کوچک داخل ستون کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC موجب فشار بالا در سرعت جریان معمول می شوند. پمپ برای حرکت دادن فاز متحرک در طول ستون باید سخت کار کند و این مقاومت باعث فشار زیاد می شود.

• آشکارساز کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC

آشکارساز کروماتوگراف مایع با کارایی بالا HPLC می تواند مولکول های مجزا را که از ستون خارج شده اند، شناسایی کند. یک آشکارساز برای اندازه گیری مقادیر آن مولکول ها به کار رفته تا شیمیدان بتواند اجزای نمونه را به طور کمی آنالیز کند.

آشکارساز خروجی را برای ثبات یا رایانه فراهم کرده که منجر به کروماتوگرام مایع می شود.

• کامپیوتر

اغلب سیستم داده ها نامیده می شود. کامپیوتر نه تنها تمام بخش های کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC را کنترل می کند، بلکه سیگنال را از آشکارساز گرفته و از آن برای تعیین زمان بازداری اجزای نمونه (آنالیز کیفی) و مقدار نمونه (آنالیز کمی) استفاده می کند.

کاربردهای کروماتوگراف مایع با کارایی بالا HPLC

• آنالیز و جداسازی ترکیبات غیر فرار یا ناپایدار حرارتی، به عبارت دیگر، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC برای جداسازی ترکیبات شیمیایی و بیولوژیکی که غیر فرار هستند، بهینه است. اگر یک ترکیب فرار باشد (مانند گاز، عطر، هیدروکربن موجود در بنزین و ...)، کروماتوگرافی گازی روش جداسازی بهتری است.

ترکیبات غیر فرار معمول عبارتند از:

1. داروهایی مانند آسپیرین، ایبوپروفن یا استامینوفن
2. نمک هایی مانند سدیم کلرید و پتاسیم فسفات
3. پروتئین هایی مانند سفیده تخم مرغ یا پروتئین خون
4. ترکیبات شیمیایی آلی مانند پلیمرها (به عنوان مثال پلی استایرن و پلی اتیلن)
5. هیدروکربن های سنگین مانند آسفالت یا روغن موتور
6. بسیاری از محصولات طبیعی مانند جینسینگ، داروهای گیاهی، عصاره های گیاهی
7. ترکیبات ناپایدار حرارتی مانند تری نیترو تولوئن (TNT) و آنزیم ها

• آنالیز کیفی با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC
• استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC جهت شناسایی ترکیبات مجزا در نمونه

رایج ترین پارامتر برای شناسایی ترکیب، زمان بازداری آن می باشد. (مدت زمان لازم که یک گونه خاص طول ستون را بعد از تزریق طی کند) بسته به آشکارساز استفاده شده، شناسایی ترکیب نیز به ساختار شیمیایی، جرم مولکولی و یا سایر پارامترهای مولکولی وابسته است.

• استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC جهت تهیه ترکیب خالص

با جمع آوری پیک ها در خروجی آشکارساز و تغلیظ ترکیب (آنالیت) با حلال پرانی می توان یک ماده خالص برای استفاده بعدی مانند سنتز آلی، مطالعات بالینی و سم شناسی تهیه کرد.

• آنالیز مقادیر بسیار کم با استفاده از کروماتوگراف مایع با کارایی بالا HPLC

آنالیز مقادیر بسیار کم مربوط به ترکیبات با غلظت های بسیار پایین معمولا کمتر از 1% وزنی اغلب ppm یا کمتر می باشد.

تعیین مقادیر بسیار کم ترکیبات در زمینه های بیولوژیکی، دارویی، سم شناسی و محیط زیست که حتی مقادیر بسیار کم از یک ماده نیز می تواند سمی و مضر باشد، بسیار حائز اهمیت است. جداسازی و شناسایی مقادیر بسیار کم در کروماتوگرافی میتواند بسیار دشوار باشد. آشکارسازهای با قدرت تفکیک بالا و حساسیت مناسب مورد نیاز است.

اندازه گیری مقدار یک ترکیب در نمونه (غلظت) با استفاده از کروماتوگراف مایع با کارایی بالا HPLC

دو روش اصلی برای تفسیر کروماتوگرام وجود دارد:

• تعیین ارتفاع پیک
• تعیین سطح زیر پیک

به منظور ارزیابی کمی ترکیب، نمونه ای با مقدار مشخص از ترکیب مورد نظر تزریق شده و ارتفاع یا سطح زیر پیک آن اندازه گیری می شود. در بسیاری از موارد بین ارتفاع یا سطح پیک با مقدار نمونه رابطه خطی وجود دارد.

ویدئو زیر اجزا و اصول کروماتوگرافی HPLC را نشان می دهد: